Ponente:

Rodrigo Alarcón Rodríguez-Paiva

Bachiller en Ciencias con mención en biología por la UPCH. Investigador desde el 2016 en el Laboratorio de Moléculas Individuales. Recientemente ganador de una beca del Instituto Max Planck de Biofísica química para estudios de postgrado en Göttingen, Alemania.

Resumen

La ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis es una enzima de alto interés biomédico debido a su importancia como diana farmacológica y la presencia de polimorfismos relacionados con resistencia antibiótica. Para facilitar su estudio, un sistema de expresión inducible en Escherichia coli ha sido desarrollado previamente. Este sistema consta de los 5 genes que codifican las subunidades de holoenzimas distribuidas entre dos plásmidos de baja copia. Desafortunadamente, este sistema presenta varias dificultades y un bajo rendimiento de proteína activa de M. tuberculosis. Cuando se probaron diferentes colonias, hubo una alta heterogeneidad en el nivel de producción de proteínas y actividad específica.
Posiblemente, esta heterogeneidad es causada por el número de copias no constante de los plásmidos y la consecuente variabilidad en la estequiometría de las subunidades. Además, la expresión de estas proteínas heterólogas ejerce un gran estrés sobre las bacterias, evidenciado por una fuerte inhibición de su crecimiento. Posiblemente, este estrés contribuye a la baja expresión y heterogeneidad en la producción de proteínas. En este proyecto, integramos los genes de las subunidades α, β, β ’y, que constituyen la apoenzima de M. tuberculosis, en el genoma de E. coli utilizando un sitio de recombinación viral. Nuestra hipótesis es que con una sola copia de los genes y con la estabilidad superior del ADN genómico, los problemas presentados se resolverían. La subunidad σA se introdujo con un plásmido de baja copia para permitir la producción de holoenzimas con diferentes factores σ. Se introdujo un segundo plásmido, que llevaba un gen GFP bajo el control de un promotor reconocido por la ARN polimerasa de M. tuberculosis. Observamos una fuerte señal correspondiente a la actividad de la enzima heteróloga cuando se indujo su expresión. Este nuevo sistema de expresión puede tener aplicaciones en detección de inhibidores, y estudios de transcripción y regulación proteica.